Из диссертации на соискание ученой степени кандидата  ветеринарных наук Самойловой Е. С.

"Алгоритмы оценки гепато- и нефропатологии при бабезиозе собак". 

(Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины». Научный руководитель: Дерхо М. А., доктор биологических наук, профессор).

 

Биохимическая оценка функций печени при бабезиозе собак

 

Печень играет жизненно важную роль в обмене веществ, а также в обезвреживании и выведении токсических метаболитов. Повреждения этого органа могут не оказывать явного влияния на его активность, так как печень обладает значительным функциональным резервом, что позволяет ей сохранять функциональную активность. Поэтому явные симптомы печеночной недостаточности проявляются только при поражении около 70% ткани органа.

Кроме того, многие заболевания собак, в том числе и бабезиоз, сопровождаются интоксикацией организма и влекут за собой развитие печеночных дисфункций. Доказано, что своевременно не выявленные функциональные нарушения печени усугубляют течение основного заболевания, пролонгируют реабилитационный период и способствуют развитию осложнений.

Диагностировать печеночную недостаточность можно с помощью биохимических маркеров, характеризующих состояние гепатоцитов и степень изменения их метаболической активности. При этом биохимический анализ крови давно вошел в практику ветеринарных специалистов. Совокупность лабораторных показателей обмена билирубина, сывороточных белков и ферментов позволяют оценить характер дисфункций печени и тяжесть поражения гепатоцитов. Эти критерии неспецифичны и не характеризуют этиологию бабезиоза, но вместе с тем существенны для оценки функционального состояния печени.

Для оценки функциональной активности клеток печени собак, инвазированных бабезиями, мы воспользовались лабораторным алгоритмом обследования функций органа по синдромному принципу (В.А. Никулин, 2007). Выделяют следующие основные патологические синдромы поражения печени (табл. 1, 2):

1. Синдром цитолиза обусловлен нарушением проницаемости мембран гепатоцитов и их органелл, приводящим к выделению составных частей клеток в межклеточное пространство и кровь.

Цитолитический синдром обусловлен тем, что все метаболические процессы в печени протекают с участием ферментов, содержащихся в гепатоцитах. При этом синтез ферментов – одна из важнейших функций печени, а динамическое постоянство ферментных констелляций в печени – необходимое условие ее нормального функционирования. Вместе с тем, все клеточные органеллы обладают своим специфическим набором ферментов, определяющим их биологическую роль. В клинической практике ферменты разделяют по функции клеток печени и их мембран, определяющих активность этих ферментов в сыворотке крови. 

 

Таблица 1. Печеночный профиль биохимических показателей крови  I опытной группы (n=20), (Х±sx)

Показатель	Референтные величины	Группы животных
		Контрольная	I опытная
Общий белок, г/л	40-73*	66,58±0,59	51,26±0,62
Альбумины, г/л	22-39*	33,96 ±0,36	24,07±0,38
Глобулины, г/л		32,52±0,80	27,19±0,71
Alb/Gl		1,04±0,02	0,87±0,03
АлАТ, U/L	9-52*	32,80±0,96	124,30±0,74
АсАТ, U/L	11-42*	38,46±1,06	84,20±1,04
Коэф. де Ритиса	1,1-1,3*	1,17±0,02	0,66±0,01
ГГТ,  U/L	1-10*	4,32±0,27	9,20±0,31
Щелочная фосфатаза, U/L	18-70*	51,62±2,45	77,27±0,74
Холестерин, ммоль/л	2,9-6,5*	4,08±0,14	5,90±0,07
Билирубин общий, мкмоль/л	3-13,5*	7,23±0,25	21,20±0,39
Билирубин прямой, мкмоль/л	0,0-5,5	2,30±0,06	7,94±0,15
Проба Троммера	0-4*	0,94±0,06	5,90±0,11**
Мочевина, ммоль/л	3,5-9,2*	4,80±0,11	16,90±0,23

* — референтные величины приведены для учёта типа биохимического анализатора, на котором выполнены данные исследования;

** — р<0,05-0,001 статистическая достоверность различий по отношению к показателям в группе контроль.

 

Среди них наиболее диагностически значимы индикаторные, выполняющие внутриклеточные функции (ЛДГ, АлАТ, АсАТ, альдолаза и др.)  и в физиологических условиях имеющие небольшое содержание в крови; экскреторные, образующиеся в печени и выделяющиеся в физиологических условиях с желчью (лейцинаминопептидаза, бета-глюкуронидаза, щелочная фосфатаза и др.).

Основной причиной цитолиза при бабезиозе является токсическое поражение печени.

«Синдром цитолиза» оценивали по активности в сыворотке крови  индикаторных ферментов (АлАТ, АсАТ), концентрации прямого билирубина и соотносили их содержание с характером нарушения целостности мембран гепатоцитов и их органелл вследствие реакции на токсическое раздражение. При этом принимали во внимание, что АлАТ – цитоплазматический фермент, и его уровень повышается при легких формах повреждения гепатоцитов. В то же время АсАТ – митохондриальный фермент, и его активность отражает более тяжелую степень поражения печеночных клеток.

Для определения активности цитолитической реакции рассчитывали коэффициент де Ритиса, отражающий соотношение между активностью  аминотрансфераз.

Мы установили, что у собак I опытной группы, спонтанно инвазированных бабезиями и характеризующихся протеканием патологии без признаков гемоглобинурии, активность АлАТ по сравнению с контролем повысилась в 3,79 раза, АсАТ – в 2,19 раза, что вызывало снижение коэффициента де Ритиса до 0,68 условных единиц (р<0,001). У животных II опытной группы (бабезиоз протекал  с наличием гемоглобинурии) активность АлАТ и АсАТ превышала контроль, соответственно, в 5,32 и 2,97 раза. 

Соотношение активности ферментов в виде коэффициента де Ритиса было равно 0,68 условных единиц (р<0,001). Хотелось бы отметить, что уровень ферментов у больных собак значительно превышал верхнюю границу референтного интервала (табл. 1, 2). Следовательно, цитолитический процесс, развивающийся в печени собак при бабезиозе, независимо от наличия гемоглобинурии, характеризуется преобладающим “вымыванием” АлАТ из гепатоцитов, степень повышения АсАТ существенно меньше.

2. Синдром холестаза обусловлен нарушением желчевыделительной функции печеночных клеток с нарушением образования желчной мицеллы и поражением мельчайших желчных протоков. О наличии синдрома судили по увеличению активности секреционного фермента ЩФ, мембранно-связанной ГГТ в сочетании с такими показателями, как увеличение  содержания общего и прямого билирубина, холестерина.

 

Таблица 2. Печеночный профиль биохимических показателей крови  собак II опытной группы (n=20), (Х±sx)

Показатель	Референтные величины	Группы животных
		Контрольная	II опытная
Общий белок, г/л	40-73*	65,00±0,33	48,85±0,32**
Альбумины, г/л	22-39*	34,45±0,21	22,80±0,33**
Глобулины, г/л		30,55±0,34	26,05±0,52**
Alb/Gl		1,13±0,04	0,87±0,1**
АлАТ, U/L	9-52*	24,20±0,36	128,80±0,62**
АсАТ, U/L	11-42*	29,5±0,54	87,50±0,31**
Коэф. де Ритиса	1,1-1,3*	1,22±0,03	0,68±0,005**
ГГТ,  U/L	1-10*	5,8±0,18	12,00±0,23**
Щелочная фосфатаза, U/L	18-70*	43,5±0,27	83,23±0,43**
Холестерин, ммоль/л	2,9-6,5*	4,20±0,17	6,20±0,10**
Билирубин общий, мкмоль/л	3-13,5*	6,92±0,15	24,60±0,20**
Билирубин прямой, мкмоль/л	0,0-5,5	2,70±0,14	11,28±0,28**
Проба Троммера	0-4*	1,24±0,24	6,80±0,12**
Мочевина, ммоль/л	3,5-9,2*	5,70±0,12	18,90±0,16**

* — референтные величины приведены для учёта типа биохимического анализатора, на котором выполнены данные исследования;

** — р<0,05-0,001 статистическая достоверность различий по отношению к показателям в группе контроль.

 

Мы установили, что бабезиоз сопровождается нарушением функции образования и оттока желчи в печени. При этом у собак I и II опытных групп по сравнению с контролем увеличивается активность ЩФ в 1,49 и 1,91 раза, ГГТ –  в 1,89 и 2,06 раза соответственно. Однако по сравнению с верхней границей референтного интервала изменения активности ферментов не столь значительны. Уровень ЩФ  превышает его на 10,4-18,9%, а ГГТ в I опытной группе соответствует интервалу, а во II превышает на 20,0%.

Одновременное повышение активности ЩФ и ГГТ в сыворотке крови  свидетельствует о печеночном происхождении увеличения ЩФ. Желчные кислоты стимулируют выработку ЩФ, однако нарушение оттока желчи препятствует ее поступлению в двенадцатиперстную кишку, что приводит к повышению концентрации ЩФ в сыворотке крови.

Хотелось бы обратить внимание на то, что уровень ЩФ незначительно повышен по сравнению с нормой, что свидетельствует о небольшом  поражении печеночной паренхимы на ранних стадиях клинического проявления спонтанного бабезиоза у собак. Однако увеличение концентрации фермента происходит вследствие его высвобождения из гепатоцитов, а не стимуляции синтеза.

Изменения в количестве холестерина хотя и не выходили за границы нормы, но характеризовались повышением величин на 44,6–47,6% по сравнению с контролем. Установлено, что печеночные клетки полностью ответственны за удаление избыточного количества холестерина с желчью. Нарушение печеночно-клеточной циркуляции вследствие замедления оттока желчи приводит к резкому снижению экскреции холестерина в просвет кишечника. Однако угнетение биосинтеза холестерина в печени преобладает над снижением его экскреции в просвет кишечника таким образом, что обеспечивает незначительное изменение концентрации холестерина в крови.

Более значительно увеличилось содержание общего и прямого билирубина не только с контролем, но и с пределами нормы. У собак I опытной группы уровень общего и прямого билирубина по сравнению с контролем вырос  в 2,94 и 3,45 раза; во II – в 3,55 и 4,17 раза. Следовательно, наличие гемоглобинурии в качестве клинического признака бабезиоза влияет на концентрацию билирубина.

Известно, что билирубин – продукт распада гемоглобина, высвобождающегося в процессе гибели эритроцитов. В физиологических условиях каждые сутки гемолизируется примерно 1% циркулирующих эритроцитов, из которых образуется 200-250 мг билирубина. Основная часть билирубина поступает в кровяное русло из клеток системы мононуклеарных фагоцитов селезенки и костного мозга. Свободный билирубин является токсичным соединением, способным проникать через гематоэнцефалический барьер, вызывая энцефалопатии. Детоксикация билирубина происходит в клетках печени, где к нему присоединяется глюкуроновая кислота, образуя глюкурониды билирубина. Эти соединения уже не токсичны и водорастворимы, что облегчает их выведение из организма в составе желчи.

Билирубин в крови здоровых собак содержится в концентрации 3,0 – 13,5 мкмоль/л и представлен двумя фракциями: нерастворимый билирубин, связанный с альбумином – непрямой билирубин, и растворимые глюкурониды билирубина – прямой билирубин.

Основываясь на вышесказанном можно утверждать, что при бабезиозе собак повреждаются клетки печени и, вследствие этого, снижается продукция желчи, вероятно, за счёт снижения энергообеспечения экскреторных функций и инфильтрации портальных трактов макрофагальными клетками. В результате повреждения паренхимы печени желчь поступает не только в желчные канальцы, но и в кровь. Эти процессы приводят к увеличению общего билирубина крови за счет обеих его фракций. Поэтому, бабезиоз характеризуется желтушностью слизистых оболочек. При этом увеличение содержания фракции прямого билирубина является ранним показателем цитолитических процессов в печени.

Следует подчеркнуть, что повышение концентрации общего билирубина в крови обусловлено не только изменением скорости экскреции билирубина в желчные капилляры, но и возрастанием скорости гемолиза эритроцитов в результате размножения бабезий. Активно делящиеся в клетках простейшие по окончанию своего цикла развития должны покидать эритроциты, что сопровождается их разрушением и высвобождением из эритроцитов гемоглобина, окислительный распад которого связан с последующим образованием билирубина. Следовательно, избыточные количества билирубина появляются в крови в том случае, когда скорость разрушения эритроцитов превышает резервные возможности печени по его трансформации.

Повышению количества билирубина в крови способствует снижение уровня альбумина, так как в крови пигмент транспортируется данным белком. Поэтому, снижение выработки альбумина  является причиной опасного повышения уровня свободного билирубина.

3. Мезенхимально-воспалительный синдром. Характеризуется повреждением мезенхимы и стромы печени. В основе развития синдрома лежат аутоиммунные процессы, а также воздействие на печень токсических агентов различного происхождения. Основным маркером синдрома является величина белково-осадочной пробы, уровень общего белка и характеристики протеинограммы.

Мы установили, что при бабезиозе у собак опытных групп уменьшается концентрация общего белка и альбуминов по сравнению с контролем соответственно на 23,0-24,8% и 29,1-33,8%. На этом фоне увеличивается содержание бета- и гамма-глобулинов, что вызывает снижение Alb/Gl – коэффициента до 0,87-0,88 условных единиц. Однако изменение уровня общего белка и альбуминов не выходит за границы референтной величины, то есть соответствует пределам нормы.  Тем не менее, величина белково-осадочной пробы (проба Троммера) значительно превышает контроль и верхнюю границу референтного интервала.

Следовательно, при бабезиозе собак наблюдается диспротеинемия, снижение коагуляционной устойчивости белков крови, что указывает на наличие мезенхимально-воспалительного синдрома. Кроме этого он сочетается с цитолитической реакцией гепатоцитов.

4. Гепатодепрессивный, синдром «гепатоцеллюлярной недостаточности» отражает изменения основных проб печени, оценивающих поглотительно-экскреторную, метаболизирующую и синтетическую функции печени. Он включает: а) печеночную (продукционную) азотемию; б) недостаточность синтетической функции печени. Гепатодепрессивный синдром оценивали по концентрации мочевины, альбуминов.

Мы установили, что в крови собак опытных групп резко возрастает уровень мочевины как по отношению к контролю, так и границам референтной величины. Её концентрация увеличивается более чем в 3 раза и свидетельствует о катаболической направленности белкового обмена в организме животных и избыточном высвобождении азота. При этом снижается биосинтетическая активность гепатоцитов, что сказывается на уменьшении концентрации в крови альбуминов по сравнению с контролем, но их значения не выходят за пределы нормы.

Следовательно, бабезиоз собак характеризуется усилением  продукционной азотемии и снижением биосинтетической активности гепатоцитов.

5. Синдром «раздражения ретикуло-эндотелия» оценивали по наличию гипопротеинемии, диспротеинемии, выражающейся в увеличении концентрации глобулинов и снижении альбумин/глобулинового соотношения. Этот синдром указывает на напряженный обмен протеинов в печени, обусловленный взаимодействием мезенхимальной ткани с поступающими с кровотоком антигенами, аллергенами и токсинами, образующимися в результате паразитирования простейших в эритроцитах собак.

Таким образом, бабезиоз представляет собой инвазионное заболевание, сопровождающееся тяжелым повреждением клеток печени по типу острого гепатита. Причиной этого является разрушение эритроцитов, так как именно в этих клетках проходит жизненный цикл бабезий, по завершению которого новые гемоспоридии выходят из них. При гемолизе эритроцитов из них высвобождаются не только новые паразиты и продукты их жизнедеятельности, но и огромное количество свободного гемоглобина. При этом в крови дополнительно циркулируют остатки разрушенных клеток. С током крови вышеперечисленные компоненты поступают в печень, подвергаясь метаболическим превращениям. В первую очередь это относится к гемоглобину, который в клетках печени разрушается окислительным путём, что приводит к образованию большого количества токсичных продуктов (прямой билирубин).

Хотелось бы обратить внимание на то, что при уровне паразитемии 3-5% процесс гемолиза эритроцитов протекает достаточно быстро и в момент обращения хозяина собаки в клинику на 2-3-е сутки у собак уже отмечается тяжелое состояние.

Токсичные продукты распада гемоглобина изменяют функциональную активность  клеток печени, о чем свидетельствуют изменения печеночного биохимического спектра сыворотки крови, которые иллюстрируют тяжесть течения токсических реакций в организме хозяина и непосредственно в печени.

 

Таблица 3. Тест-система оценки дисфункций печени при бабезиозе

Показатель	Физ. норма	При бабезиозе
Общий белок	40-73 г/л	N
Альбумины	22-39г/л	N
Alb/Gl		менее 0,9
АлАТ	до 52 U/L	↑↑↑
АсАТ	до 42 U/L	↑↑
Кэфф. де Ритиса	1,1-1,3	менее 0,7
ГГТ	до 10 U/L	N; ↑
ЩФ	18-70 U/L	↑
Холестерин	2,9-6,5 ммоль/л	N
Билирубин общий	3-13,5 мкмоль/л	↑↑↑
Билирубин прямой	до 5,5 мкмоль/л	↑↑↑
Проба Троммера	до 4 усл. ед.	↑
Мочевина	3,5-9,2 ммоль/л	↑↑↑

N — соответствует границам нормы; ↑ — увеличено незначительно; ↑↑ — умеренно увеличено; ↑↑↑  — сильно увеличено.

 

Анализ печеночного спектра биохимических показателей позволил нам составить лабораторный алгоритм, который характеризует дисфункцию печеночных клеток и позволяет оценить степень повреждения печеночных клеток при бабезиозе (табл. 3).

Данная тест-система биохимического анализа крови помогает в оценке функционального состояния печени по синдромальному принципу, позволяет оценить степень изменения метаболической активности гепатоцитов и на основе этого дает возможность комплектования комплексной схемы лечения, а также возможный исход заболевания.

На основании этого мы рекомендуем в комплексную схему симптоматической химиотерапии бабезиоза обязательно включать препараты, обладающие гепатопротекторными свойствами. Это продиктовано ещё дополнительно и тем фактом, что противопаразитарные средства, в большинстве своём, в организме хозяина проявляют токсичные свойства по отношению к клеткам печени (N. Koch, P.Kelly, 1991).